4例人类白细胞抗原罕见等位基因的结果分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.44.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：虽然国内与国外关于新等位基因的报道较多，但是，因某些等位基因首次发现较晚，而后却再次被检测到，并且等位基因频率很低，此类相关文章报道甚少，这些等位基因往往被忽视。
目的：检测与确认4例临床移植配型供受者携带的罕见等位基因。
方法：采用快速DNA提取试剂盒从全血样本中提取基因组DNA，经人类白细胞抗原基因商品化测序分型试剂盒检测和SSP高分辨试剂盒验证，得到人类白细胞抗原高分辨分型结果。
结果与结论：被检测到的4个罕见等位基因分别为B*27:15、B*51:39、C*07:66和C*08:22。对于以上4个等位基因虽被美国骨髓库列为罕见等位基因，但在中国可能并不罕见。事实证明，被美国骨髓库列为罕见等位基因的C*08:22为中国汉族人群常见等位基因。

关键词: 器官移植, 器官移植临床实践, 人类白细胞抗原, 罕见等位基因, 测序分型, 基因组DNA, SSP, 常见等位基因, B*27:15, B*51:39, C*07:66, C*08:22

Abstract:

BACKGROUND: Many articles concerned novel alleles reported in China and outside China, but some alleles were detected lately. After that, these alleles were tested again. Because frequencies of these alleles are very low, few relevant articles are reported, so these alleles are ignored easily.
OBJECTIVE: To test and identify four human leukocyte antigen rare alleles that patients and donors carries.
METHODS: Genomic DNA was extracted automatically from blood samples using quick DNA purified kit, typed by human leukocyte antigen locus commercial sequence-based typing kits and confirmed by sequence-specific primers high-resolution kits.
RESULTS AND CONCLUSION: Four detected rare alleles are B*27:15, B*51:39, C*07:66 and C*08:22. The four above-mentioned human leukocyte antigen rare alleles defined by National Marrow Donor Program are not rare in China. The facts prove that C*08:22 which was defined a rare allele by National Marrow Donor Program before is a common allele in Chinese Han nationality.

Key words: HLA antigens, alleles, bone marrow, organ transplantation, cell transplantation

中图分类号:

R318

王大明，何柳媚，邹红岩，高素青. 4例人类白细胞抗原罕见等位基因的结果分析[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(44): 7809-7814.

Wang Da-ming, He Liu-mei, Zou Hong-yan, Gao Su-qing. Result analysis of four human leukocyte antigen rare alleles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(44): 7809-7814.

图/表（结果） 4

参考文献

[1]Voorter CE,Swelsen WT,van den Berg-Loonen EM. B*27 in molecular diagnostics: impact of new alleles and polymorphism outside exons 2 and 3. Tissue Antigens.2002; 60(1):25-35.
[2]Tang TF, Hou L, Tu B, et al. Identification of nine new HLA class I alleles in volunteers from the Singapore stem cell donor registries. Tissue Antigens. 2006;68(6):518-520.
[3]Deng Z, Xu Y, Wang D, et al. Description of two novel alleles HLA-Cw*0766 and Cw*0767 identified in a Chinese Han individual by sequence-based typing. Hum Immunol. 2010; 71(1):93-95.
[4]Xu YP, Deng ZH,Wang DM,et al. A novel HLA-Cw*08 allele, Cw*0822, identified by genomic full-length cloning and sequencing. Tissue Antigens. 2009;74(6): 555-556.
[5]鲍自谦,王大明,邓志辉,等.中国南方汉族人群中一个常见型新等位基因HLA-C*08∶22的基因频率调查和分析[J].中国实验血液学杂志 ;2011;19(6):1493-1495.
[6]Zhu F, He Y, Zhang W, He J, et al. Analysis for complete genomic sequence of HLA-B and HLA-C alleles in the Chinese Han population. Int J Immunogenet. 2011;38(4): 281-284.
[7]Xu YP, Deng ZH, Zou HY, et al. Cloning and sequencing HLA-A and -B genomic DNA and analyzing polymorphism in regulatory regions in Chinese Han individuals. Yi Chuan. 2010;32(7):685-693.
[8]刘艳,周媛,张毅,等. 济南汉族人群人类白细胞抗原B座位等位基因多态性分析[J]. 山东医药,2013,53(10):46-47.
[9]Cano P, Klitz W, Mack SJ, et al. Common and well-documented HLA alleles: report of the Ad-Hoc committee of the american society for histocompatiblity and immunogenetics. Hum Immunol. 2007;68(5):392-417.
[10]Zeng JQ, Xu YP, Wang DM, et al. Single nucleotide polymorphisms in 22 HLA-Cw alleles in Chinese Han population. Yi Chuan. 2010;32(5):473-479.
[11]何柳媚,王大明,徐筠娉,等.汉族人群中新等位基因人类白细胞抗原-DPA1~＊01：11的鉴定[J].中国组织工程研究,2012, 16(53): 9994-9998.
[12]胡彬,迟晓云,冯智慧,等.新等位基因HLA-A~＊11：97与HLA-B~＊44：127的确认[J].中国组织工程研究,2012,16(53): 9999-10004.
[13]戚新,李归冀,章旭,等.人类白细胞抗原新等位基因HLA-A＊31：22的序列分析及确认[J].中华微生物学和免疫学杂志,2012, 32(12):1011-1014.
[14]唐剑频,蒋丰慧,石美森,等. 22个常染色体单核苷酸多态性的群体遗传学研究[J].中华医学遗传学杂志,2012,29(6):720-722.
[15]Cano P, Klitz W, Mack SJ, et al. Common and well-documented HLA alleles: report of the Ad-Hoc committee of the american society for histocompatiblity and immunogenetics. Hum Immunol. 2007;68(5):392-417.
[16]Steiner NK, Kosman C, Jones PF, et al. Twenty-nine new HLA-B alleles associated with antigens in the 5C CREG. Tissue Antigens. 2001;57(5):481-485.
[17]Li J, Qu J, Zhang X, Zhang C, et al. Characterization of 236 novel alleles at the HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 and -DPB1 loci from China Marrow Donor Program. Tissue Antigens. 2011; 78(4):267-270.
[18]Lebedeva TV, Ohashi M, Huang A, et al. Emerging new alleles suggest high diversity of HLA-C locus. Tissue Antigens. 2005;65(1):101-106.
[19]Kim E, Lee EJ, Lim YH, et al. Identification of a novel HLA-DRB1*12 allele (DRB1*1210) in the Korean population. Tissue Antigens. 2004;64(4):518-519.
[20]Xu Y, Deng Z, O'hUigin C, et al. Characterization and polymorphic analysis of 4.5 kb genomic full-length HLA-C in the Chinese Han population. Tissue Antigens. 2011;78(2): 102-114.
[21]王大明,邹红岩,何柳媚,等.一例供者携带的C＊03：100等位基因的测序分析[J].国际输血及血液学杂志,2012,35(5):390-392.
[22]梁国威,邵冬华,何美琳,等.等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率[J].中国实验血液学杂志,2012, 20(6): 1486-1491.
[23]Deng ZH, Wang DM, Gao SQ, et al. Characterization of the novel HLA-Cw*0624 allele identified by sequence-based typing. Tissue Antigens. 2010;75(1):83-84.
[24]Gans CP, Mitton W, Ng J, et al. Seven new HLA-B alleles associated with antigens in the B7 CREG. Tissue Antigens. 2002;59(3):229-231.
[25]曾健强,徐筠娉,王大明,等.汉族人群中22个HLA-Cw等位基因全长序列单核苷酸多态性分析[J].遗传,2010,32:473-479.

引言

材料方法

设计：随机样本检测，单一样本观察。

时间及地点：实验于2010年10月至2013年3月在深圳市血液中心免疫遗传室完成。

材料：

全血样本：来源于参加临床移植配型无关供/受者共650例，其中4例携带罕见等位基因。采用5%EDTA抗凝外周全血，备用。

实验方法：

基因组DNA制备：取5 mL抗凝外周血，采用全血基因组DNA提取试剂盒中的0.3 mL全血制备基因组DNA的实验程序，剩余全血置-30 ℃冰箱冻存备用。DNA浓度调节在50 µg/L左右，纯度A₂₆₀/A₂₈₀值控制在1.80左右。琼脂糖电泳显示无降解。

人类白细胞抗原，A、B、C、DRB1和DQB1五个位点高分辨水平基因测序分型：人类白细胞抗原A、B、C(检测第2，3和4外显子)、DRB1(检测第2外显子)以及DQB1 (检测第2，3外显子) 位点PCR扩增：严格按照AlleleSEQR 人类白细胞抗原测序试剂盒说明书操作。PCR加样及扩增反应：①将相关试剂从冰箱取出，置于加样洁净台上。人类白细胞抗原A、B、C位点在1只容量为1.5 mL的离心管内每人份加入16 µL PCR反应缓冲液和0.3 µL Taq酶，人类白细胞抗原-DRB1、人类白细胞抗原-DQB1位点在1只容量为1.5 mL的离心管内每人份加入8 µL PCR反应缓冲液和0.1 µL Taq酶，混匀后，离心。②人类白细胞抗原A、B、C位点每人份取16 µL混合液加入反应管中，混合液中加入4 µL基因组DNA，人类白细胞抗原DRB1、人类白细胞抗原-DQB1位点每人份取 8 µL混合液加入反应管中，混合液中加入2 µL基因组DNA，混匀后，离心。③将反应板封盖后放入9700 PCR扩增仪中，扩增反应采用20 µL反应体系，按照如下循环参数进行扩增：95 ℃ 10 min→36个循环：96 ℃ 20 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 3 min，扩增反应产物板置于4 保存。

PCR产物的直接测序：PCR产物的纯化采用ExoSAP-IT酶处理。去除多余的游离PCR引物和底物dNTPs；即在反应管中加入3 µL ExoSAP-IT，低速离心混合后，置PCR仪37 ℃ 30 min→80 ℃ 15 min，纯化后的扩增产物板置于4 ℃保存。纯化处理后的产物作为测序反应模板。采用试剂盒配有的测序引物对人类白细胞抗原C位点第2，3和4外显子的正向和反向进行序列测定。测序反应采用10 µL反应体系，该体系由8 µL测序引物和2 µL经ExoSAP-IT处理过的PCR产物组成，反应条件为：25个循环：96 ℃ 20 s→50 ℃ 30 s→60 ℃ 2 min，4 ℃保存。测序反应产物采用乙醇/醋酸钠/EDTA沉淀法。加入15 µL超纯甲酰胺溶液(Hi-Di Formamide)，在PCR扩增仪上95 ℃变性2.5 min。经纯化后的测序反应产物于ABI Prism^TM 3730型基因测序仪电泳检测并收集电泳后的序列数据信息。

结果分析：将ABI Prism^TM 3730型基因测序仪电泳检测并收集电泳后的序列数据信息导入Assign-SBT 3.5.1.45(Conexio Genomies，Western Australia)分析软件，分析受检者人类白细胞抗原-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1位点的等位基因型。

高分辨PCR-SSP基因分型：对于含有模棱两可和罕见等位基因的标本采用高分辨PCR-SSP方法进行精确分型，按照试剂盒说明书进行操作。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，特异性阳性条带与说明书的阳性条带图谱比对，基因分型结果即可确认。

讨论

人类白细胞抗原基因位于人类第6号染色体短臂。人类白细胞抗原基因测序分型技术是人类白细胞抗原基因分型的“金标准”^[6-7] 。目前，人类白细胞抗原SBT基因测序分型技术被业内公认为器官移植前和造血干细胞移植前人类白细胞抗原高分辨配型的最佳方法^[8] 。自1998年以来，等位基因的数量急速增长，有些等位基因经美国骨髓库(简称NMDP)频率统计已经被确定为常见和确定的(CWD)等位基因^[9] ，而有些等位基因则被暂时划为罕见等位基因。截至2013年1月更新的国际免疫遗传IMGT/人类白细胞抗原数据3.11.0版(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.htmL)显示已发现人类白细胞抗原A、B 、C、DRB1和DQB1基因各2 132个、2 798个、1 672个、1 196个和179个。美国国家骨髓库(National Marrow Donor Program，NMDP)网站(http：//bioinformatics.nmdp.org/)公布的罕见等位基因资料[Rare Allele List File. Version 3.9.0(08/2012)]显示，自1987年至2012年8月检测出的2 523 247个人类白细胞抗原-B等位基因中B*27:15被检测出29次，其中26次是从亚洲或太平洋地区的标本中检出的，B*51:39被检测出2次，亚洲或太平洋地区及高加索人中各检出一次^[10] 。自1987年至2012年8月检测出的919 984个人类白细胞抗原-C等位基因中C*07:66被检出0次，C*08:22被检测出8次，亚洲或太平洋地区检出7次。ASHI(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics)规定，人类白细胞抗原A、B和C位点等位基因频率小于1/50 000，即为罕见等位基因。由此看来，以上提到的4个等位基因已经定义为罕见等位基因。
由于近3年骨髓库入库数据刚刚从低分辨水平转为高分辨水平，中国在判定等位基因是否常见时，通常借鉴美国骨髓库频率统计的相关资料，一些在中国首次被发现后再次被检测到而在美国国家骨髓库公布的数据中却显示发现次数极少或被划为罕见的等位基因也陆续浮出水面，例如B*51:39，C*07:63，C*07:66，C*08:22等^[11-13] 。由于国内骨髓库高分入库数据总数量仍在持续增长阶段，并未进行系统统计计算，对于以上4个等位基因虽被美国骨髓库列为罕见等位基因，但在中国可能并不罕见^[14] 。随着高分数据入库的逐渐增加，并进行有效地统计计算，相信一些被美国骨髓库划为罕见的等位基因在中国汉族人群中极有可能成为CWD(常见和确定的)等位基因^[15] 。2013年3月中国造血干细胞库召开工作会议，其中，将库中检出的人类白细胞抗原分型结果涉及的等位基因进行统计学计算，在业界曾经被广泛认为罕见的等位基因，在表中均可见较高的频率。例如，C*08:22是本实验室此文作者在2008年采用自行研制的人类白细胞抗原C位点地1-7外显子试剂盒对中国汉族人群全血样本进行筛查发现的，虽然被发现较晚，但此等位基因为中国汉族常见等位基因^[15] ，在那份频率表中等位基因频率为0.945 3。B*51:39^[2]和C*07:63的等位基因频率分别为0.001 8和0.100。B*35:30本实验室在进行临床移植配型标本高分辨确认时^[16] ，经2种方法核实，检测到供者携带此基因，在频率表中此等位基因的频率为0.001 5。人类白细胞抗原C*03:100是2011年首次被发现^[17] ，此等位基因的携带者为中国人，2012年在做临床移植配型高分确认时被再次检测出。短短不到1年时间被检测到2次，向这些虽然被发现较晚的等位基因排名比较靠后，但频率不一定低，2013年中华骨髓库工作会议下发的“中国常见及确认的人类白细胞抗原等位基因表(CWD)(1.01版)中C*03:100频率为0.004 7。C*03:17^[18] 、DRB1*12:10^[19] 、C*07:66和C*04:82的等位基因频率均显示为中国常见等位基因^[3，20-21] 。
随着每个位点等位基因的数量逐年增多，模棱两可结果的比例也随之增高，2013年1月18日IMGT/人类白细胞抗原(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig. html)关于模棱两可结果组合的统计数据充分证实了这点^[22] 。形成原理主要为2种：一是常规检测区序列完全相同导致的，即差异碱基在检测区外；二是由于PCR产物的杂合性，有时不同等位基因的组合可得到相同的杂合子序列，即检测区内杂合序列一致。因此，当对临床移植配型样本进行人类白细胞抗原基因测序分型时，人类白细胞抗原B、C位点均为第1-4和第5-7外显子的扩增产物，依据模棱两可结果形成原理，对于差异碱基在检测区外的，例如，C*08:01:01/08:22除了可以采用PCR-SSP高分试剂中的C*08来解决外，由于C*08:01:01/08:22的差异碱基为第6外显子的1034碱基位分别为C*08:01:01为G, C*08:22为A[4-5]，所以可以加做C6F，即第6外显子的正向引物测序，即可将两个等位基因区分开；对于检测区杂合序列一致的，例如，C*03:04/03:28，14:02/14:06这个组合出现时，可以采用PCR-SSP高分试剂中的C*03或者C*14来确认，或者加做C位点的检测区外外显子测序进一步解决。当前，大多数模棱两可结果可用高分辨水平PCR-SSP试剂盒进行进一步确认，但随着等位基因的继续增多，模棱两可结果的比例也不断提高，PCR-SSP方法已经不能完全解决高分确认精确分型的问题，这将给高分确认带来挑战，商品化的检测区外测序试剂非常昂贵，直接影响到检测成本，建立高效、低耗、快速的精确分型解决策略具有重要意义^[23-24] 。本实验室根据GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中公布的人类基因组人类白细胞抗原全序列的参考序列，由于人类白细胞抗原-C位点商品化试剂盒扩增产物包括了第5-7外显子特异性产物，因此成功地设计了人类白细胞抗原-C位点检测区外的测序引物，并且对200份已知基因型的样本进行测试结果一致^[25] 。美国国家骨髓库(National Marrow Donor Program，NMDP)网站(http：//bioinformatics. nmdp.org/)公布的罕见等位基因资料[ Rare Allele List File. Version 3.9.0(08/2012)]显示，自1987年919984份标本检测人类白细胞抗原C基因C*03:100被发现的次数为零。查阅大量国内和国外文献后，自首次报道后尚未见再次被报道。虽然C*03:100发现比较晚^[21] ，但在1年左右的时间在中国同一地区被检测到2次，此基因有可能在中国人群中为较常见基因，SSP高分辨试剂盒还无法进行鉴定，为节省时间只能采用加做第5-7外显子测序进行进一步鉴定，为发放报告争取宝贵时间。